沉默PPP3CA对后肾间充质细胞MET转化、凋亡、增殖及迁移的影响

肾脏是人体重要器官,肾脏发育对肾脏的形成和功能至关重要,其中后肾间充质细胞 (Metanephric mesenchyme,MM) 间质-上皮转化 (Mesenchymal-epithelial transition,MET) 是肾单位形成的关键环节。qRT-PCR和Western blotting实验检测蛋白质磷酸酶3催化亚基α (Protein phosphatase 3 catalytic subunit alpha,PPP3CA) 在不同状态MM细胞株mK3、mK4中的表达谱及对MET标志蛋白调控作用;采用慢病毒包装方式构建稳定敲低PPP3CA的mK4细胞株;采用CCK-8、EdU实验、细胞划痕实验、流式细胞技术分别检测PPP3CA对上皮样后肾间充质细胞株mK4细胞生长、迁移、凋亡的调控作用。PPP3CA在mK4细胞中表达量较间质样后肾间充质细胞mK3更高,敲低PPP3CA后,检测MET标志物及细胞生物学行为,结果显示敲低PPP3CA显著上调上皮细胞标志物E-cadherin表达,促进MET过程,且促进细胞凋亡,抑制细胞增殖和迁移。此外,敲低PPP3CA促进ERK1/2磷酸化,提示PPP3CA生物学功能的调控机制可能与其去磷酸化ERK1/2蛋白相关。以上结果提示PPP3CA在MM细胞MET转化和生物学行为调节中发挥重要功能,为发现和解析肾发育过程中潜在的关键调节因子提供了新的理论基础。     

鉴定单克隆抗体识别蛋白质抗原表位方法的建立

为了建立鉴定治疗性单克隆抗体识别蛋白质抗原表位的方法,选择程序死亡受体-1 (PD-1) 作为目的蛋白。基于丙氨酸扫描策略,建立了定点突变技术和哺乳动物细胞表达系统相结合的抗原突变体快速表达方法,确定了真核表达元件扩增和细胞转染表达的条件。共表达了150个PD-1蛋白突变体,鉴定了这些突变体与抗PD-1抗体帕博利珠单抗的结合能力。根据蛋白突变体与抗体的结合力并结合蛋白结构分析确定了帕博利珠单抗的抗原表位,与已报道的基于晶体结构的抗原表位高度一致,表明本方法操作简单、准确性高,可用于治疗性单克隆抗体的抗原表位作图。     

部分扩增与双片段连接相结合制作长基因定点突变

重叠延伸PCR是基因定点突变的主要方法,但是以该方法制作长基因定点突变时,往往遇到难以获得第二轮PCR产物或容易引入新的非预期突变等问题。此时,可先以重叠延伸PCR扩增含突变位点的部分基因片段,再将其连入适当载体获得重组质粒。若该扩增片段两侧的酶切位点在质粒载体上不单一,则可采用双片段连接法构建完整质粒。以制作视网膜母细胞瘤基因S780E定点突变为例,直接以重叠延伸PCR扩增全长基因时未能得到理想的目标产物。故先扩增含点突变的F3片段,再将其与源自原始质粒的F2片段一起连入含F1片段的质粒载体而构建完整质粒。两个筛选出的重组质粒经序列检测完全符合目标突变序列特征,验证了该方案的可行性。该方法作为重叠延伸PCR的补充,可为许多长基因定点突变提供解决方案。     

基因拷贝数对重组毕赤酵母产谷氨酰胺转胺酶的影响

基于毕赤酵母核糖体DNA序列 (rDNA),构建多拷贝谷氨酰胺转胺酶基因表达载体pPICZα-rDNA- mtg,并转化到表达前导肽 (Pro peptide或pro) 的宿主菌pGAP9-pro/GS115,得到共表达菌株pro/rDNA-mtg (GS115)。实时荧光定量PCR (qPCR) 分析了4株阳性表达菌株中mtg基因拷贝数,进一步研究了不同基因拷贝数对重组毕赤酵母产酶的影响及高产菌株在3 L发酵罐高密度发酵。结果表明,被检测的4株阳性表达菌株中mtg拷贝数分别为2.21、3.36、5.72和7.62 (mtg-2c、mtg-3c、mtg-6c和mtg-8c),其发酵产酶能力和蛋白质表达水平为mtg-3c>mtg-2c>mtg-6c>mtg-8c;高密度发酵较低和较高拷贝数的两株菌mtg-3c和mtg-6c,发酵上清的最高酶活和单位菌体酶活分别为3.12 U/mL、52.1 U/g湿重和2.07 U/mL、36.5 U/g湿重,其中单位菌体酶活mtg-3c是mtg-6c的1.4倍;mtg-3c纯化酶的最高酶活达到7.21 U/mL,蛋白浓度为437.2 μg /mL。通过分析拷贝数对重组毕赤酵母产酶的影响,发现mtg-3c适合pro/rDNA-mtg中pro和mtg共表达,MTG高酶活与菌株较高分泌蛋白有关。     

剑叶龙血树内生放线菌活性菌株的筛选和鉴定

为筛选具有抗菌抗肿瘤活性的药用植物内生菌资源,该文对300余株分离自中国云南西双版纳及越南地区剑叶龙血树的内生放线菌采用琼脂块扩散法进行抗病原细菌活性筛选、平板对峙法进行抗真菌活性筛选、SRB法测定菌株的细胞毒活性及PCR扩增方法筛选非核糖体肽合成酶NRPS基因及聚酮合酶PKS-I、PKS-Ⅱ基因;对得到的优势菌株经8种培养基进行发酵,采用10种病原细菌、3种病原真菌及2种人肿瘤细胞株测试其发酵粗提物的抗菌及抗肿瘤活性以确定最佳发酵培养基;用16S rRNA基因测序方法初步鉴定5株优势菌株的分类地位。结果表明:初筛得到5株抗菌活性、体外细胞毒活性及NRPS、PKS相关基因表达阳性的菌株S01-S05,其中4株(S01-S04)属于链霉菌属、1株(S05)属于类诺卡氏菌属;菌株经不同培养基发酵后产物的抗菌和抗肿瘤活性不同,其中Streptomyces sp. S04在7种培养基中的发酵提取物对8种测试病原菌均有较强抑制作用,且该菌株用Medium C的发酵提取物对人肝癌Hep G2细胞株抑制率达到100%,为剑叶龙血树内生菌活性成分挖掘及新型抗菌药物筛选奠定了基础。     

基于转录组测序的Cd胁迫下芹菜细胞自噬相关基因的筛选

细胞自噬是植物逆境应答过程中最常见的保护机制之一。动物中,自噬相关基因抵御镉(Cd)毒害的功能研究较清楚,但植物却知之甚少。文中以芹菜品种‘皇后’为试材,采用外源Cd(终浓度为0、2、4、8mg/L)添加营养液水培处理,利用转录组测序(RNA-seq)技术筛选细胞自噬相关差异基因并进行q RT-PCR验证。结果表明Cd胁迫对芹菜植株产生了明显的毒害作用,并与浓度间产生了量效关系。在筛选的8个差异表达的自噬相关基因中,ATG8a、ATG8f、ATG13、AMPK-1、AMPK-2基因随Cd浓度升高表达上调,ATG12、VPS30和VPS34则先上调后下降,说明自噬相关基因可能通过表达上调增加了自噬小体结构以抵御Cd毒性作用;而高浓度Cd(8mg/L)可能超出芹菜的耐受范围,导致多个自噬基因又出现表达下调趋势。以上结果有助于后期自噬相关基因的功能研究,为进一步探讨芹菜对Cd胁迫的耐性机制提供参考依据。     

血清sST2在心力衰竭诊断、预后中的应用价值

心力衰竭(心衰)的发病率正随着人口老龄化的加速而显著上升,目前仍然是一个重大的公共健康问题。尽管近年来在心衰治疗方面取得了显著成效,但患者的生存率依旧很低,预后差,确诊心衰后5年内死亡率高达50%。如果能够对心衰进行快速有效的诊断并按危险程度进行合理分层,将为临床医生制定治疗方案提供重要的参考依据。生物标志物在心衰的诊断、疗效评估及预后判断方面都具有重要的意义。心力衰竭是一种复杂的疾病,涉及多种生理病理过程。心力衰竭时,神经内分泌系统被激活,同时伴随着血容量和心室壁压力增加,心室肌细胞分泌NT-proBNP/BNP,因此,其可作为心衰诊断和预后生物标志物。然而血浆中NT-proBNP/BNP易受到年龄、性别、体型、左室肥大、心动过速、右心室过载、低氧血症、肾脏功能等诸多因素影响。sST2作为一种新型心力衰竭标志物,近年来备受关注,它不仅能够反映心肌纤维化程度并预测是否发生心室重构,且不受年龄、性别、肾功能等因素的影响,同时具有更低的参考变化值和个体指数,更适合用于连续监测和指导治疗,是评价心力衰竭的理想指标之一。文中对近年来sST2在心衰诊断和预后方面的研究进展进行总结归纳,并对其发展趋势进行展望。     

温度诱导Targetron系统用于大肠杆菌高效基因失活

构建基于TeI3c/4c嗜热二型内含子的温度诱导Targetron基因失活系统 (Thermotargetron),并应用于中温微生物基因编辑。在大肠杆菌HMS174 (DE3) 基因组中,选择Subunit of flagellum基因 (fliC) 和C4 dicarboxylate orotate:H+ symporter基因 (dctA) 为靶基因。根据TeI3c/4c DNA识别规则,在fliC和dctA基因中选择fliC489a、fliC828s、fliC1038s和dctA2a位点为基因打靶位点。使用重叠延伸PCR方法,基于pHK-TT1A质粒构建打靶载体。打靶载体转化HMS174菌株,对数期转化子培养液48 ℃热激1 h后涂布于氯霉素抗性LB平板上。使用菌落PCR和DNA测序检测突变株并计算基因失活效率。获得突变株后,通过琼脂穿刺和碳源代谢实验,鉴定ΔfliC、ΔdctA突变株表型变化。菌落PCR测序结果表明,TeI3c/4c插入到fliC和dctA基因设计位点,且打靶效率高达100%。突变株表型验证实验表明,ΔfliC突变株运动能力显著下降,ΔdctA突变株苹果酸代谢能力缺失。综上所述,文中建立了一套适用于嗜中温微生物的温度诱导型、高效基因失活系统,该系统可通过控制宿主菌在48 ℃保温时间实现高效、靶向、精准基因失活。     

绵羊粒细胞集落刺激因子原核表达与提纯及用于颗粒细胞培养的效果

文中旨在研究粒细胞集落刺激因子(Granule cell stimulating factor,GCSF)对绵羊颗粒细胞体外培养过程中细胞增殖和凋亡的影响,明确GCSF对绵羊颗粒细胞生存的调节作用,为今后该蛋白用于羊繁育方面的研究奠定基础。原核克隆表达纯化羊GCSF蛋白,纯化的蛋白用M-NSF60细胞检测生物学活性,将纯化的GCSF添加到颗粒细胞培养基中作为试验组,以培养基中未添加GCSF的细胞为对照,利用Alarmarblue检测细胞增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化。结果表明,羊GCSF可以原核表达并纯化,并且具有生物学活性。在24 h和48 h时,在0.06–600 ng/mL的范围内随着加入GCSF的终浓度增加,细胞活力升高。试验组颗粒细胞体外培养24 h后,与阴性对照相比,细胞周期的分布显著改变,S期细胞比例显著减少(P0.05),G2/M期细胞比例显著增多(P0.05)。试验组凋亡率和对照组相比,48 h检测时凋亡率显著降低(P0.05)。综上表明,GCSF在体外培养的绵羊颗粒细胞中,可调控绵羊颗粒细胞周期,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。